高效液相色譜儀在進(jìn)行多成分的復雜樣品分離時(shí)，經(jīng)常會(huì )碰到前面的一些成分分離不*，后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰形較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內全部洗脫并相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。
在高效液相色譜儀中流速（壓力）梯度洗脫和溫度梯度洗脫效果不大，而且會(huì )帶來(lái)一些不利影響，因此，高效液相色譜儀中的梯度洗脫通常指流動(dòng)相梯度洗脫，即在分離過(guò)程中改變流動(dòng)相的組成或濃度。
高效液相色譜儀梯度洗脫系統也稱(chēng)為梯度洗脫或程序洗脫。在相同的分析周期中，流動(dòng)相的濃度比按一定的步驟不斷變化，稱(chēng)為梯度洗脫。原理：流動(dòng)相由幾種不同極性的溶劑組成。通過(guò)改變流動(dòng)相中溶劑的比例和改變流動(dòng)相的極性，每個(gè)組分都有一個(gè)合適的容量系數k，樣品中的所有組分都能在最短的時(shí)間內達到最佳的分離特性：提高柱效率和提高分離效率。檢測靈敏度。敏感。當樣品中某一峰的k‘值比上一峰高出幾十至數百倍時(shí)，梯度洗脫效果特別好。在梯度洗脫過(guò)程中，必須采用恒流泵來(lái)保證流速的穩定性，否則很難得到重復的結果。
高效梯度液相色譜儀進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，選定溶劑A、B之后，設定梯度速度和梯度時(shí)間，確定梯度曲線(xiàn)形狀，要以經(jīng)濟的梯度洗脫程序，實(shí)現樣品的最佳化分離。影響梯度洗脫的因素有：
1、溶劑的純度要高，否則會(huì )使梯度洗脫的重現性變壞。
2、梯度混合的溶劑互溶性要好，應防止不互溶的溶劑進(jìn)入色譜柱。
3、注意溶劑的粘度和密度對混合流動(dòng)相組成的影響。
4、梯度洗脫應使用對流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇型檢測器，而不能使用對流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測器。
